一、 什么是PCR實(shí)驗(yàn)室

PCR 是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction)的簡稱。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)也可以 當(dāng)作一項(xiàng)極其重要的酶促合成 DNA 技術(shù)。PCR 又稱為無細(xì)胞克隆系統(tǒng)或特異性 DNA 序列體外引物定向酶促擴(kuò)增法，是基因擴(kuò)增技術(shù)的一次重大革新，它可將極微量的靶 DNA 特異地?cái)U(kuò)增上百萬倍。聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）是在 DNA 聚合酶催化下，以母鏈 DNA 為模板以特定引物為延伸起點(diǎn)，通過變性、退火、延伸等步驟，體外復(fù)制出與母鏈模板 DNA 互補(bǔ)的子鏈 DNA 的過程。是 一項(xiàng) DNA體外合成放大技術(shù)，能快速特異地在體外擴(kuò)增任何目的 DNA。可用于基因分離克隆，序列分析，基因表達(dá)調(diào)控，基因多態(tài)性研究等許多方面。一對合成 DNA 的引物經(jīng)過高溫變性、低溫退火和中溫延伸三個階段為一個循環(huán),每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一倍,一般樣品是經(jīng)過 30 次循環(huán),最終使基因放大了數(shù)百萬倍; 將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳,經(jīng)溴化乙錠染色,在紫外燈照射下肉眼能見到擴(kuò)增特異區(qū)段的 DNA 帶。

二、PCR實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)原則（以非洲豬瘟檢測PCR實(shí)驗(yàn)室為例）：

1、非洲豬瘟檢測實(shí)驗(yàn)室的選址：

   符合國家檢測實(shí)驗(yàn)室的相關(guān)規(guī)定，具體適用于屠宰場來說，可選擇辦公樓或者獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)室空間，選址絕對不能和屠宰線相通，如果實(shí)驗(yàn)室陽性對照污染，會污染整個屠宰生產(chǎn)線，勢必對屠宰場造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

   個別不專業(yè)的實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)建造公司因?yàn)椴涣私夥侵挢i瘟檢測實(shí)驗(yàn)室的檢測流程，造成設(shè)計(jì)布局不合理，對后期開展工作造成很大的不便及生物安全隱患。

2、主體結(jié)構(gòu)：

   目前實(shí)驗(yàn)室的主體多為彩鋼板、鋁合金型材。室內(nèi)所有陰角、陽角均采用鋁合金R50內(nèi)角鋁，從而解決容易污染、積塵、不易清掃等問題。并且彩鋼板結(jié)構(gòu)牢固，線條簡明，美觀大方，密封性好。

3、標(biāo)準(zhǔn)的四區(qū)分隔和氣壓調(diào)節(jié)：

   將 PCR 過程分成試劑準(zhǔn)備、標(biāo)本制備和 PCR 擴(kuò)增區(qū)及產(chǎn)物分析檢測區(qū)四個獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)區(qū)。整個區(qū)域有一個整體緩沖走廊。每個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)區(qū)設(shè)置有緩沖區(qū)，同時各區(qū)通過氣壓調(diào)節(jié)， 使整個 PCR 實(shí)驗(yàn)過程中試劑和標(biāo)本免受氣溶膠的污染并降低擴(kuò)增產(chǎn)物對人員和環(huán)境的污染。

另外：

   PCR 實(shí)驗(yàn)室根據(jù)使用儀器的功能合理設(shè)置各個工作區(qū)域，如采用聚合酶聯(lián)反應(yīng)：則設(shè)置試劑儲存和準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)四個單獨(dú)的工作區(qū)域，這是最常用的分區(qū)方式。樣品需要粉碎處理的，還需增設(shè)樣品粉碎區(qū)；若使用實(shí)時熒光 PCR 法：基因擴(kuò)增區(qū)、基因產(chǎn)物分析區(qū)可以合并在一個房間內(nèi)；采用標(biāo)本處理、核酸提取及擴(kuò)增檢測為一體的全自動化 PCR 分析儀，則標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)可合并為一個區(qū)域，因此 PCR 實(shí)驗(yàn)室原則上設(shè)置五個區(qū)或四個區(qū)或三個區(qū)或二個單獨(dú)的工作區(qū)。

  核酸擴(kuò)增前區(qū)和核酸擴(kuò)增后區(qū)可設(shè)在一個房間內(nèi)，但必須在滿足下列要求的前提下：

a. 核酸擴(kuò)增前區(qū)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)設(shè)置兩個不同位置的實(shí)驗(yàn)區(qū)，試劑配置在超凈工作臺中操作，樣品處理在生物安全柜內(nèi)操作。

b. 在核酸擴(kuò)增后區(qū)使用全封閉的擴(kuò)增和檢測系統(tǒng)，如實(shí)時熒光 PCR 儀等。

c. 每個實(shí)驗(yàn)人員使用各自的試劑、耗材、移液器和盛放污染物的盛器。

d. 在實(shí)驗(yàn)前后對操作區(qū)域和共享器具進(jìn)行清潔及消毒。

e. 各區(qū)域的試劑、器具、儀器和設(shè)備為該區(qū)專用，不得交叉使用。

4、非洲豬瘟檢測實(shí)驗(yàn)室的布局：

非洲豬瘟檢測實(shí)驗(yàn)室用的儀器為熒光定量PCR，因此核酸擴(kuò)增和分析在一個區(qū)，實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)需要如下功能房間：PCR緩存走廊、帶緩存間的配液室、帶緩存間的樣品處理室、帶緩存間的核酸擴(kuò)增分析區(qū)及實(shí)驗(yàn)室用具消毒室。

5、非洲豬瘟檢測實(shí)驗(yàn)室生物安全保護(hù)：

理論上講非洲豬瘟檢測實(shí)驗(yàn)室是BSL-2 生物安全實(shí)驗(yàn)室，需要配置二級生物安全柜，推薦選擇70%外排，30%內(nèi)循環(huán)，各功能房間緩存設(shè)置更衣柜和消毒器，各區(qū)的實(shí)驗(yàn)服專用，物料流通需要配置帶紫外線的互鎖的傳遞窗，實(shí)行人流物流分開設(shè)置。

6、非洲豬瘟檢測實(shí)驗(yàn)室消毒：

在三個實(shí)驗(yàn)區(qū)和三個緩沖區(qū)頂部以及傳送窗內(nèi)部安裝有紫外燈，供消毒用。

在試劑準(zhǔn)備區(qū)和標(biāo)本制備區(qū)還設(shè)置移動紫外線燈，對實(shí)驗(yàn)桌進(jìn)行局部消毒。

7、非洲豬瘟檢測實(shí)驗(yàn)室機(jī)械連鎖不銹鋼傳遞窗：

試劑和標(biāo)本通過機(jī)械連鎖不銹鋼（不建議使用電子連鎖方式）傳遞窗傳遞，保證試劑和標(biāo)本在傳遞過程中不受污染（人物分流）。

8、非洲豬瘟檢測實(shí)驗(yàn)室地面

地面建議使用 PVC 卷材地面或自流坪地面，整體性好。便于進(jìn)行清掃，耐腐蝕。沒有條件的也可采用水磨石地面，或大塊的瓷磚（至少 800mm×800mm）接縫需要小于 2mm。

9、非洲豬瘟檢測實(shí)驗(yàn)室照明

燈具要選用凈化燈具，能達(dá)到便于清洗、不積塵的特點(diǎn)。

三、空氣流與壓差要求

PCR 實(shí)驗(yàn)室的空氣流向必須嚴(yán)格按照試劑儲存和準(zhǔn)備區(qū)→標(biāo)本制備區(qū)→擴(kuò)增區(qū)→擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)空氣壓力逐漸遞減方式進(jìn)行，防止擴(kuò)增產(chǎn)物順空氣氣流進(jìn)入擴(kuò)增前的區(qū)域。風(fēng)速流向不得混亂。

為了保證房間內(nèi)的壓差和避免污染，應(yīng)在空調(diào)面板處寫清楚送風(fēng)機(jī)和排風(fēng)機(jī)的開啟順序和關(guān)閉順序，先后順序不得混亂。

空氣潔凈級別不同的相鄰房間之間的靜壓差應(yīng)大于 5 帕，潔凈室(區(qū))與室外大氣的靜壓差應(yīng)大于 10 帕，應(yīng)配備監(jiān)測靜壓差的設(shè)備，并定期監(jiān)控。

一般情況下，試劑配制室及樣品處理室宜呈微正壓，以防外界含核酸氣溶膠的空氣進(jìn)入，造成污染；可以通過控制進(jìn)風(fēng)風(fēng)量大于排風(fēng)風(fēng)量達(dá)到正壓效果。

核酸擴(kuò)增室及產(chǎn)物分析室應(yīng)呈微負(fù)壓，以防含核酸的氣溶膠擴(kuò)散出去污染試劑與樣品，可以通過控制排風(fēng)風(fēng)量大于進(jìn)風(fēng)風(fēng)量達(dá)到負(fù)壓效果。

在理想情況下，PCR 實(shí)驗(yàn)室緩沖間內(nèi)，可設(shè)置正壓，使室內(nèi)空氣不流向室外，室外空氣不流向室內(nèi)。PCR實(shí)驗(yàn)室進(jìn)風(fēng)由原有中央空調(diào)控制的要求將中央空調(diào)風(fēng)口安裝到指定定點(diǎn)。

四、實(shí)驗(yàn)室設(shè)施要求：

實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)設(shè)施設(shè)計(jì)：包括實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)裝修、實(shí)驗(yàn)室凈化工程、實(shí)驗(yàn)室供排水工程、實(shí)驗(yàn)室電路系統(tǒng)。

1）實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)裝修需要潔凈天花、地板、隔斷，合理設(shè)置緩存間及配置凈化門、觀察窗、傳遞窗等。

2）實(shí)驗(yàn)室凈化工程 實(shí)驗(yàn)室應(yīng)配備單獨(dú)送排風(fēng)設(shè)施，試劑配置區(qū)、核酸提取區(qū)和擴(kuò)增分析區(qū)應(yīng)配備凈化系統(tǒng)。

3）實(shí)驗(yàn)室供排水工程包括非手動水龍頭、不銹鋼或PP水池和緊急淋浴器及供排水管線管路。

4）實(shí)驗(yàn)室電路系統(tǒng):根據(jù)儀器的功率配置合適的功率，特別注意高壓滅菌鍋的功率，注意實(shí)驗(yàn)室用電安全。

5）配備適用的應(yīng)急器材，如應(yīng)急照明設(shè)備、消防器材、意外事故處理器材等。

五、實(shí)驗(yàn)室儀器及設(shè)備

1）更衣室儀器及設(shè)備：更衣柜或掛衣架、鞋柜以及消毒器和烘干器。

2）配液室儀器及設(shè)備：國鉉超凈工作臺、冰箱、小型離心機(jī)、旋渦振蕩器、微量移液器等。

3）樣品處理室儀器及設(shè)備：離心機(jī)、組織研磨機(jī)、Ⅱ級生物安全柜、恒溫水浴鍋、冰柜等、可移動紫外消毒器。

4）核酸提取室儀器及設(shè)備：核酸提取儀、Ⅱ級生物安全柜、恒溫水浴鍋、小型離心機(jī)、微量移液器、可移動紫外消毒器等。

5）擴(kuò)增分析區(qū)儀器及設(shè)備：熒光定量PCR儀、電腦、打印機(jī)、不間斷電源、可移動紫外消毒器等。

6）消毒洗滌室：高壓滅菌器、干燥箱、器皿柜等。

六、實(shí)驗(yàn)室面積及設(shè)備間距

一般來說各房間的面積沒有嚴(yán)格要求，只需能放置所需儀器設(shè)備，并且便于人員操作即可，但是有生物安全柜的房間面積不能小于10平米，并且每增加一臺生物安全柜，房間就要增加 10 平米。各實(shí)驗(yàn)室緩沖間的面積一般為 1300*（1300 或 1500）mm 為宜，并且緩沖間的面積不能 大于實(shí)驗(yàn)室房間面積的 1/8。

在做平面設(shè)計(jì)的時候，首先要考慮的因素是就是“安全”，實(shí)驗(yàn)室是最易發(fā)生爆炸、火災(zāi)、毒氣泄露等的場所。我們在做平面設(shè)計(jì)的時候，應(yīng)盡量地要保持實(shí)驗(yàn)室的通風(fēng)流暢、逃生通道暢通。根據(jù)國際人體工程學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)。

我們做如下的劃分以供參照：

實(shí)驗(yàn)臺與實(shí)驗(yàn)臺通道劃分標(biāo)準(zhǔn)(通道間隔用 L 表示)

L>500mm 時，一邊可站人操作；

L>800mm 時，一邊可坐人操作；

L>1200mm 時，一邊可坐人，一邊可站人，中間不可過人;

L>1500mm 時，兩邊可坐人，中間可過人；

L>1800mm 時，兩邊可坐人，中間可過人可過儀器

天平臺、儀器臺不宜離墻太近，離墻 400mm 為宜。為了在工作發(fā)生危險(xiǎn)時易于疏散，實(shí)驗(yàn)臺間的過道應(yīng)全部通向走廊。另:實(shí)驗(yàn)室建筑層高宜為 3.7 米-4.0 米為宜，凈高宜為2.7米-2.8 米，有潔凈度、壓力梯度、恒溫恒濕等特殊要求的實(shí)驗(yàn)室凈高宜為 2.5 米-2.7 米（不包括吊頂）；實(shí)驗(yàn)室走廊凈寬宜為 2.5 米-3.0 米.普通實(shí)驗(yàn)室雙門寬以 1.1 米-1.5 米(不對稱對開門)為宜,單門寬以 0.8 米-0.9 米為宜。

七、潔凈裝修要求

潔凈室（區(qū)）的內(nèi)表面應(yīng)平整光滑、無裂縫、接口嚴(yán)密、無顆粒物脫落，并能耐受清洗

和消毒，墻壁與地面的交界處宜成弧形或采取其他措施，以減少灰塵積聚和便于清潔。

潔凈室(區(qū))內(nèi)各種管道、燈具、風(fēng)口以及其他公用設(shè)施，在設(shè)計(jì)和安裝時應(yīng)考慮使用中

避免出現(xiàn)不易清潔的部位。

潔凈室(區(qū))的窗戶、天棚及進(jìn)入室內(nèi)的管道、風(fēng)口、燈具與墻壁或天棚的連接部位均應(yīng)

密封。

八、人流路徑與物流路徑

進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室區(qū)域工作人員應(yīng)該按照以下路徑：

公共清潔區(qū)——更衣間（更換潔凈服）——緩沖間——污染實(shí)驗(yàn)區(qū)

工作人員退出實(shí)驗(yàn)室的路徑為：

污染試驗(yàn)區(qū)——緩沖間——淋浴間（有條件的可設(shè)置）——更衣間——公共清潔區(qū)

所有的物品進(jìn)入實(shí)驗(yàn)區(qū)必須經(jīng)過雙扉互鎖傳遞窗，利用傳遞窗消毒后才可進(jìn)入，實(shí)驗(yàn)室

內(nèi)所有物品的也必須經(jīng)過傳遞窗才可以傳遞到實(shí)驗(yàn)室以外的清潔公共區(qū)。

門的開啟方向

實(shí)驗(yàn)室建筑層高宜為 3.7 米-4.0 米為宜，PCR 實(shí)驗(yàn)室凈高宜為 2.5 米-2.7 米（不包括吊頂）；實(shí)驗(yàn)室走廊凈寬宜為 2.5 米-3.0 米.普通實(shí)驗(yàn)室雙門寬以 1.1 米-1.5 米(不對稱對開門)為宜,單門寬以 0.8 米-0.9 米為宜。

一般實(shí)驗(yàn)室門主要向里開，但如有危險(xiǎn)的房間，房門應(yīng)朝外開，房門材質(zhì)最好選擇壓力

玻璃。

有壓差梯度的房間，門的開啟方向應(yīng)朝向正壓方向一側(cè)開啟；

考慮到消防安全，對于那些主要逃生門的開啟方向應(yīng)朝向清潔區(qū)方向開啟。

九、工作服要求

在凈化車間內(nèi)工作的人員應(yīng)穿著符合要求的工作服。工作服的選材、式樣及穿戴方式應(yīng)與生產(chǎn)操作和空氣潔凈度級別要求相適應(yīng)，并不得混用。潔凈工作服的質(zhì)地應(yīng)光滑、不產(chǎn)生靜電、不脫落纖維和顆粒性物質(zhì)。無菌工作服必須包蓋全部毛發(fā)、胡須及腳部，并能阻留人體脫落物。不同空氣潔凈度級別使用的工作服應(yīng)當(dāng)分別清洗、整理，必要時消毒或滅菌。工作服洗滌、滅菌時不應(yīng)帶入附加的顆粒物質(zhì)。工作服應(yīng)制定清洗周期。

進(jìn)入各個區(qū)域必須嚴(yán)格按照單一方向進(jìn)行，不同的工作區(qū)域使用不同的工作服（例如不同的顏色）。工作人員離開時，不得將工作服帶出。

實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立、執(zhí)行人員進(jìn)出潔凈區(qū)的清潔程序和管理制度，人員清潔程序合理。

十、人員培訓(xùn)

配備至少兩名專業(yè)實(shí)驗(yàn)員，能夠獨(dú)立處理樣品、提取核酸及核酸擴(kuò)增，熟練掌握超凈工作臺、生物安全柜、自動提取儀、實(shí)時熒光定量PCR的使用，加強(qiáng)生物安全方面的培訓(xùn)，避免實(shí)驗(yàn)室污染。

附：非洲豬瘟檢測實(shí)驗(yàn)室要求參考

一、非洲豬瘟

   非洲豬瘟（African swine fever, ASF）是由非洲豬瘟病毒（ASFV）引起豬的一種急性、熱性、高度接觸性動物傳染病，臨床上以高熱、網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)出血和高死亡率為特征，易感豬群的病死率高達(dá)100%。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為法定報(bào)告動物疫病，我國將其列為一類動物疫病。目前，針對非洲豬瘟防控，尚無有效的商品化疫苗，防控重點(diǎn)是做好生物安全管理和早期診斷撲殺凈化。

二、非洲豬瘟感染規(guī)律

   源于：《FAO動物生產(chǎn)與衛(wèi)生手冊——非洲豬瘟：發(fā)現(xiàn)與診斷》

   ASF自然感染潛伏期為4-19天。

   最急性和急性感染通常在4-10天死亡。

   在臨床癥狀出現(xiàn)的2天前，ASF感染動物開始散播大量病毒。

   感染后7-9天血清轉(zhuǎn)陽，抗體持續(xù)很長時間，可持續(xù)終生。

三、非洲豬瘟檢測實(shí)驗(yàn)室設(shè)備儀器配置方案

   用于非洲豬瘟病毒檢測的實(shí)驗(yàn)室，推薦配置以下設(shè)備：II級生物安全柜、混勻儀（渦旋振蕩器）、高速離心機(jī)、金屬浴或恒溫水浴鍋、組織破碎儀（均質(zhì)器/勻漿儀）、移液器、冷藏冷凍冰箱、高壓滅菌鍋。同時，建議實(shí)驗(yàn)室配備合適的個人防護(hù)用品，如防護(hù)服、手套、口罩等。

    1. II級生物安全柜：提供無菌環(huán)境用于處理組織樣品等（避免外部環(huán)境污染樣品），同時保證病毒不向?qū)嶒?yàn)室環(huán)境擴(kuò)散（保證人員和環(huán)境安全）。

    2.高速離心機(jī)：用于血清的分離和樣品的處理的分離。

    3. 金屬浴或恒溫水浴鍋：提供恒溫環(huán)境，用于樣品處理過程中的裂解過程。建議選擇帶有震蕩功能的設(shè)備，或者配備單獨(dú)的混勻儀（渦旋振蕩器）。

    4.組織破碎儀（均質(zhì)器/勻漿儀）：根據(jù)樣品類型選擇便攜式組織破碎儀或者高通量組織破碎儀等（在用組織檢測時使用）。

    5. 移液器：用于實(shí)驗(yàn)過程中的微量體積加樣。

    6.冷藏冷凍冰箱：用于樣品、試劑盒試紙等儲存，建議定期監(jiān)測冰箱溫度。

    7.高壓滅菌器：用于實(shí)驗(yàn)結(jié)束后樣品及用具的滅菌處理，避免樣品帶有病毒時泄露導(dǎo)致疫情擴(kuò)散。